LES OUTILS DE DIAGNOSTIC
La détection de l’ADN viral - Test « P.C.R » Polymeras Chain Reaction
Le principe est l’amplification du génome du virus à partir d’un prélèvement de tissus :
- Sur un lot de poissons apparemment sains, pour avoir une fiabilité maximum, on utilise le broyat d’un mélange d’organes de plusieurs sujets (2, 3, 5, en fonction des laboratoires) : rates + reins + encéphales sont utilisés aux Etats-Unis, et, reins + branchie, sont utilisés en Belgique, Allemagne, Pays Bas. Le même test, fait avec les branchies seules est moins fiable, car pas assez sensible. Fait avec un échantillon de sang, il n’est pas approprié car la faible virémie induit une mauvaise sensibilité du test.
- Sur un poisson malade, la détectabilité par ce test est encore plus grande (comme pour tous les autres tests) et l’examen fait sur un prélèvement branchial seul offre déjà un très bon niveau de détectabilité. L’analyse PCR faite sur un prélèvement de branchie permet de garder en vie le sujet examiné.
Dans l’objectif de pouvoir quantifier le virus chez des porteurs sains, la « PCR en temps réel » et la Nested PCR sont à l’étude. Au Japon cette méthode de PCR en temps réel est utilisée actuellement, la seul différence avec la PCR classique, est qu’elle permet de quantifier la présence du virus dans l’échantillon prélevé.
L’avantage de ce test est sa bonne sensibilité.
Et qu’il est possible de le faire sans tuer le sujet, avec un prélèvement branchial, mais seulement si le poisson est en phase d’expression clinique de la maladie.
La sérologie : test « ELISA »
On révèle une présence d’anticorps au bout de plusieurs semaines, dans un échantillon de sang prélevé aux carpes sous anesthésie, ce qui évite de sacrifier les poissons apparemment sains lors d’une introduction par exemple.
Cette méthode non développée encore en France (mais actuellement utilisée avec satisfaction au Etats-Unis) ne pourra l’être que si une demande forte de la profession justifie sa recherche et son développement.
L’inconvénient de ce test est le temps nécessaire pour avoir le résultat, et qu’il ne fera pas la différence entre, un poisson malade, ou un poisson vacciné, ou un poisson immunisé car ayant survécu à une infection par le KHV.
Son avantage est sa grande fiabilité, et qu’il ne nécessite pas de tuer les sujets.
Cependant, il doit être pratiqué sur un échantillon statistique d’environ 60 sujets pour être significatif.
La microscopie électronique
La taille du virus de 10 à 100 nanomètres rend sa visibilité par microscope optique impossible, alors que la microscopie électronique permet la visualisation complète du virus dans les tissus infectés prélevés, à conditions que les prélèvements aient été effectués à un moment de virémie maximale.
Inconvénients de cette méthode: lourde économiquement et ne permet pas de dépistage sur des porteurs sains.
L’isolement sur culture de lignées cellulaires : « CCB » ou « KF1 »
Le prélèvement (surnageant du broyat d’organes) du sujet suspect est mis en contact avec des cellules vivantes. Le virus, s’il est présent, détruit ces cellules par effet cytopathogène en quelques jours.
La sensibilité de ce test est néanmoins très inférieure à celle du test P.C.R..
La mise en contact des poissons suspects, avec des poissons sains
La mise en contact des deux lots est faite à des températures favorables au développement de la maladie, pendant un délai nécessaire à l’incubation (10-15 jours en fonction de la température). On observe ou pas l’apparition des symptômes de la maladie.
Les autres méthodes de dépistage
- l’hybridation in situ
- la technique IFAT (immunofluorescence)
- la technique d’ électro-poration sur cellules est en cours de développement
Conclusion
Sur des poissons apparemment sains, l’efficacité maximale de ces tests n’est atteinte que si les analyses sont faites sur des poissons provenant d’une eau entre 18°C et 26°C permettant le développement de la maladie. On peut aussi injecter des corticoïdes pour les «immunodéprimer» et favoriser le développement de la maladie.
Sur des poissons malades toutes ces conditions n’ont pas besoin d’être regroupées pour que les tests soient fiables.
- les tests sont nettement plus fiables sur des poissons malades que sur des poissons apparemment sains ou porteurs sains
- le résultat d’une analyse démontrant qu’un poisson est sain n’est pas fiable à 100%. En revanche, en cas de résultat positif, il est improbable d’avoir un faux résultat (si le test a été fait dans des conditions optimales).
- Un premier test, peut toutefois être confirmé ou infirmé par un deuxième test de principe différent.
Pourissement des ouilles
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